明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒動(dòng)態(tài)已更新
本試劑盒采用凝膠反相酶譜法(Zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性及其無(wú)活性前體酶原譜系。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制備含有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳時(shí)SDS與樣本中的MMP可逆性結(jié)合，導(dǎo)致MMP氫鍵和疏水鍵破壞而不能發(fā)揮分解明膠的作用。電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer孵育，MMP恢復(fù)活性，凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測(cè)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測(cè)靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行25-50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè)（如果樣本MMP含量高，孵育時(shí)間短，不用換液可最多50次），如果小膠加樣孔為10~15個(gè)，則總計(jì)可最多檢測(cè)500~750個(gè)樣品。
染色步驟：
1. 此染色液即為工作液，使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝
膠，并緩慢搖動(dòng)2h；
2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；
3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動(dòng)2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進(jìn)行脫色，直至獲得清晰的藍(lán)色的條帶和干凈的背景（通常此過(guò)程需要2～4h，也可脫色過(guò)夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈的背景）；
4. 對(duì)凝膠進(jìn)行分析和照相，凝膠可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對(duì)
凝膠進(jìn)行處理后保存。
安全性：含有甲醇，無(wú)特殊毒性，按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。
MMP透明條帶的大小、位置和酶譜的圖例。注意因?yàn)闃悠肺催€原和加熱變性，條帶位置并不對(duì)應(yīng)推算的蛋白分子量。下圖1，正常血漿樣品陽(yáng)性對(duì)照可能出現(xiàn)的反相顯示的透明條帶位置：66kDa(MMP-2)，72kDa(proMMP-2)，87kDa(MMP-9)，92kDa(proMMP-9)，注意血漿中只有很少量的激活狀態(tài)的66kDa的MMP2，增加上樣量在ProMMP2下面隱約可見(jiàn)(最右側(cè)泳道)。
不同于正常血漿MMP酶譜，每種組織樣品(如牙周膜韌帶組織)都具有自己特定的MMP活性酶譜，部分proMMP9(92kDa)可能會(huì)結(jié)合一個(gè)25kDa微球蛋白形成MMP9復(fù)合物，條帶位置約125-130kDa，其二聚體條帶大約在215-225kDa位置(圖中并未顯現(xiàn))，多聚體條帶位置240kDa，嚴(yán)格說(shuō)他們都是MMP9復(fù)合體，但也有人稱其為proMMP-9。注意在這種組織中activeMMP9活性低，但activeMMP2活性高，與血漿MMP活性酶譜形成了鮮明的對(duì)比
參考文獻(xiàn)：
1.大腸桿菌及脂多糖對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響
2.綠茶多酚EGCG增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及其相關(guān)機(jī)制研究
更新時(shí)間：2022-11-16 
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